【推荐】CAR-T研究中几个技术问题的讨论
点击上方蓝色小字↑↑↑------“干细胞者说”，选关注，即可订阅本科普号。本刊号部分资料来自网络。
当你特别烦躁的时候，先保持冷静，或者看一部开心的电影，或者喝一大杯茶，或者坐在马路牙子上看看美女发发呆，这些都能让你的心情瞬间好起来。
-------步步先生
很高兴看到越来越多的同行介入CAR-T细胞治疗研究，本文简单罗列了一些CAR-T研究中常被忽略的问题及思考，也期待更多的达人参与探讨与分享，共同推进国内CAR-T研究推陈出新，创造出世界一流的技术成果。
1，病毒转导效率：
这是一个大家关注较多的问题。转导效率取决于病毒滴度和转导操作。
影响病毒滴度的因素包括：包装 细胞的培养、质粒转染效率、质粒大小特别是包装片段的大小、包装系本身及病毒RNA转录效率，而后者与DNA序列关系较大；提高病毒浓度的方法有很多，根据卡卡罗特的经验，反转录病毒和慢病毒通过超滤方式进行浓缩是一个较省力的方案。
转导操作时，细胞状态（对反转录病毒更加重要）和操作方式都有很大的影响，强烈建议使用病毒感染增强剂如NovoNectin和/或Polybrene（有一定细胞毒性）等。
CART研究中为检测方便而使用GFP等标记基因的做法不可取，标记基因添加与否，会影响病毒包装效率和CAR的表达效率，并不能很好指示CAR-T研究。建议采用直接针对特异性CAR分子的流式检测，既方便未来临床质控，也可以比较CAR分子的表达效率。
2，CAR分子表达效率：
这是一个往往被大多数玩家忽略的问题，但一个细胞上CAR分子的数量会严重影响到对靶细胞的结合效率与活化效率。CAR分子表达效率与所用的启动子、增强子及核酸序列高度相关。
CAR分子与靶细胞表面的抗原结合具有协同效应，当CAR-T细胞表面CAR分子表达量较高时，CAR-T与靶细胞的结合是多个抗原-CAR之间的结合，能显著提高结合能力。
CAR分子与靶细胞的多价结合是激活CAR-T分子的基础。除新鲜回输的细胞外，实现体内定植的CART细胞一般处于非活化状态，只有与靶细胞结合后，CAR分子成簇化，胞内区反式激活，进而活化CAR-T细胞进行杀伤。如果CAR分子表达效率低，可能导致CAR-T细胞不能有效活化，从而影响治疗效果。
转基因沉默也是定植后的CAR-T细胞失效的一个可能的风险。不同启动子沉默的机会不同，一些病毒来源的启动子如CMV启动子比EF1a和Actin启动子更容易发生转基因沉默。
3，T细胞的培养方案：
传统IL-2培养CIK的方法获得的T细胞以TEF为主，相比之下使用Tscm Expander等IL-15培养的T细胞含有较高比例的Tscm，研究表明同样数量细胞移植，移植Tscm的子代细胞数量较Tcm高10~100倍（Gattinoni L, Nat. Med.,2011）。
不同发育阶段T细胞增殖能力（Gattinoni L.）
卡卡罗特推测，（原理上）病毒转导后的CAR-T细胞可以使用靶抗原如CD19作为进一步活化培养的蛋白因子，有兴趣的同行可以试一下。
传统CIK培养中很多人忽略CD28抗体对T细胞活化及防止T细胞失能的效果。T细胞的有效活化依赖于TCR途径的激活和共刺激信号特别是CD28信号途径的激活。缺乏共刺激信号时，失能的T细胞表现为接受抗原再刺激时抗原特异性无反应，IL-2分泌减少或缺乏，细胞不能增殖。
4，CAR-T研究的几个问题：
实体瘤CAR-T治疗：卡卡罗特对此缺乏信心。对实体瘤的研究大多集中在解决微环境抑制和趋化浸润两个环节，但如果实体瘤异质性问题不能解决，即使CAR-T能够暂时清除部分肿瘤细胞，其他肿瘤细胞可能快速增殖让问题变得棘手，毕竟抗体药物没有解决的普适性和特异性靶点问题在CAR-T治疗上同样存在。所以目前看到的较好的临床数据基本来自血液肿瘤，且靶点都不是肿瘤特异性靶点而是细胞系靶点。
实体瘤的异质性（凌少平，PNAS 2015）
通用CAR-T：UCAR最主要解决的是培养时间和质量控制问题。也许对AML等会有所帮助，但供着来源、潜在风险、CAR-T细胞保存、配型或者MHC敲除的复杂性、体内存活时间短等等因素外，来自一个供体的CAR-T细胞到底能够满足多少患者使用多大程度上真正降低成本是一个巨大障碍，毕竟国内自体T细胞培养并不是主要成本所在。
带开关的CAR：如果CAR-T的细胞因子风暴和B细胞缺失算CAR-T的两个主要的副作用，带自杀基因的CAR是一个有效的解决方案。但随着CAR-T临床经验积累，细胞因子风暴的控制与护理已经达到可接受范围。
逃逸与复发（耐药性）：作为医药人能够解决一部患者的病痛，已经是对人类了不起的贡献。让医药界兴奋的PD1单抗在大多数肿瘤上20%左右的ORR丝毫未能削弱大家的热情。CAR-T在血液肿瘤上如何防止复发是一个可能更容易解决，且对患者更有意义的研究课题。诺华近期CTL019 r/r ALL实现93% CR震惊同行，但一年40%多的复发率仍然是一个巨大的困扰（爱之太深，期望太奢）。卡卡罗特更看好如何用大剂量CAR-T一次清剿所有病变细胞及多靶点CAR-T或者混合CAR-T对防止耐药性产生的作用。
作者：卡卡罗特
感谢好友卡卡罗特授的原创作品，本文为公众号CytoCares首发，我喜欢的公众号之一。
精彩科普：
《如何讲干细胞的潜能性才不会出错》☜点我
《干细胞家族说》☜点我
《免疫细胞家族》☜点我
长按此处，关注本号